Huitfeldt er datter av lagdommer Iver Huitfeldt (1943–) og lektor Sidsel Scharning (1940–1990). Hun ble født i Bærum, men vokste opp på Jessheim i Akershus. Hun tilhører den dansk-norske adelsslekten Huitfeldt ([vittfelt]), og er niese av politikeren Fritz Huitfeldt (H). Hun er også etterkommer av Norges rikskansler Jens Bjelke. Hun er søster av Astrid Huitfeldt og Anders Huitfeldt.[3] Huitfeldt er utdannet cand.philol. med hovedfag i historie fra Universitetet i Oslo 1996.
Anniken Huitfeldt har også grunnfag i statsvitenskap fra Universitetet i Oslo 1992, samt grunnfag i geografi fra London School of Economics 1993. Hun var forsker ved Fafo 2000–2005, og styremedlem i Redd Barna 2001–2005. Hun har vært medlem av to utvalg som har avgitt norsk offentlig utredning (NOU), henholdsvis Boligutvalget 2000–2002 og Kvalitetsutvalget for grunnopplæring 2001–2003. Huitfeldt er gift og har tre barn.
Huitfeldt var leder i Ullensaker AUF 1985–1988. Styremedlem i Akershus AUF 1986–1990, fylkessekretær 1988–1989. Sentralstyremedlem i Norges Gymnasiastsamband 1987–1988. Sentralstyremedlem i AUF 1990–1994, nestleder 1994–1996, og leder 1996–2000. President i Foreningen Nordens Sosialistiske Ungdom i 2000, visepresident i International Union of Socialist Youth 2000–2001. Huitfeldt var 2. vararepresentant til Stortinget for Arbeiderpartiet i Akershus 1993–97, samt 4. vararepresentant 2001–05.