Enzymkoblet immunadsorberende analyse

Enzymkoblet immunadsorberende analyse (engelsk: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)) benyttes for å kvantifisere og detektere et antistoff eller et antigen.

Utførelse

Prinsippet er å få et antigen til å binde seg til vegger og / eller bunn i brønnene i en mikrotiterplate.

En 96-hulls mikrotiterplate som benyttes for ELISA

Til brønnene settes så en prøve med det antistoff, rettet mot det antigen som skal bestemmes.Etter at antisfoffene i prøveløsningen har bundet seg, vaskes bort komponenter i prøven som ikke har bundet seg, vanligvis med en PBS-løsning med tilsats av Tween. Deretter tilsettes en løsning med et sekundært antistoff fra et annet dyreslag (traceren) som kun har spesifisitet for det primære antistoff. Til traceren har man koblet (konjugert) et enzym (for eksempel pepperrotsperoxidase eller alkalisk fosfatase). Overskuddet av tracer vaskes ut. Det enzym som er tilbake bundet gir så i neste steg et signal gennom en enzymreaksjon der produktet er et farget eller fluorescent stoff. Dette bestemmes med spesialtilpasset fotometer. Signalet er direkte relatert tll mengden bundet tracer.

For pepperrotsperoxidase (HRP, fra engelsk Horseradish peroxidase) brukes vanligvis TMB (3,3',5,5'-Tetrametylbenzidin). TMB danner et blått produkt i nærvær av veskeperoxid og peroxidase hvis fargeforandring kan avleses på et spektrofotometer ved en bølgelengde på 370 eller 655 nm. Reaksjonen kan stoppes ved tilsats av syre eller annen stoppreagens. Med svovelsyre blir TMB gul og fargen kan leses ved 450 nm.

For alkalisk fosfatase brukes vanligvis p-nitrofenylfosfat (vannløselig og fargeløst) som substrat. Det omvandles under reaksjonen til p-nitrofenol (sterkt gult i alkalisk løsning, med absorpsjonsmaksimum ved 405 nm) og fosfat. P-nitrofenylfosfat er kommersielt tilgjengelig i tablettform som enkelt løses i ønsket buffert for å slippe vanskelig oppveiing.

Hydrolyse av p-nitrofenylfosfat til p-nitrofenol og fosfat. I reaksjonsformelen er ingen hensyn blitt tatt til protonering av inngående reaktanter.

Bruk

Metoden benyttes i kliniske laboratorier for å bestemme antistoffer som produseres som svar på en virusinfeksjon eller en autoimmun sykdom eller for å bestemme andre sykdomsrelaterte eller fysiologisk aktive stoffer, for eksempel kreftmarkører. I en del tilfeller kan også lavmolekylære stoffer, for eksempel hormoner, visse substanser relaterte til nukleinsyrer, plantegifter, dopingmidler eller andre helt syntetiske stoffer (som for eksempel anvendes som medisiner) bestemmes. Selv innen matvareindustrien er det tilempninger. For spesifikke nukleinsyresekvenser bruker man andre metoder, se PCR.

Mange ELISA-bestemmelser foretas i store analyseroboter uten menneseklig innblanding, dels for å spare (arbeidskraft er dyr) og dels for å standardisere bestemmelsen (hver laboratorietekniker arbeider på sitt eget vante vis, og det blir alltid små variasjoner mellom forskjellige laboranter). For de vanligste bestemmelsene finnes det ferdige reagenssatser (kit) med reagens som er veltilpassede til hverandre og standardiserte av produsenten. Reagens for ELISA regnes til gruppen diagnostika, som defineres som reagens for klinisk-kjemiske analyser som ikke kan foretas med konvensjonelle kjemiske metoder.

I en beslektet bestemmelsesperiode er tracerantistoffet direkte konjugert til en fluorescent gruppe (fluorofor) i stedet for et enzym.

Eksempler på bruk i sykdomsbekjempelse

Dr. Dennis E. Bidwell og Alister Voller skapte ELISA-tester for detektering av forskjellige typer sykdommer, som for eksempel dengue, malaria, Chagas sykdom, paratuberkulose og andre. ELISA-tester brukes også til in vitro-diagnostisering i laboratorier. Ellers kunne nevnes:

• deteksjon av Mycobacterium-antistoffer i tuberkulose
• deteksjon av rotavirus i feces
• deteksjon av hepatitt B-markører i serum
• deteksjon av hepatitt C-markører i serum
• deteksjon av enterotoxin av E. coli i feces
• deteksjon av HIV-antistoffer i blod
• deteksjon av SARS-CoV-2-antistoffer i blod

Mer om koronavirus: I forbindelse med covid-19-bekjempelsen har legemiddelfirmaet Roche utviklet en test for detektering av om en person er blitt infisert: Da brukes den beskrevne fremgangsmåte, og platen er coatet med det virale proteinet, det vil si SARS-CoV-2s piggprotein.

Indirekte ELISA

Ved indirekte ELISA dekkes en mikrotiterplate med antigen som bindes til bunn og vegger i mikrotitrerplaten. Så skylles det antigenet som ikke har bundet seg til platen bort. Etter dette dråpes prøven på mikrotitrerplaten, og antistoffer i prøven binder til antigenet på platen. Etter inkubasjonen med prøven vaskes atter igjen ubundne komponenter bort. Deretter tilsettes en løsning av et antistoff (såkalt tracer) som binder spesifikt til antistoffet i prøven. Til dette andre antistoffet, traceren, er det blitt koblet (konjugert) et enzym som kan detekteres, og hermed kan også forekomsten av antistoffer i prøven bestemmes.

Sandwich-ELISA

Sandwich-ELISA innebærer detektering av et antigen. En mikrotiterplate bestrykes, coates, med antistoffer som binder til det antigenet i prøven man vil bestemme. Et andre antistoff, rettet mot en annen epitop på det antigenet man vil bestemme. Dette andre antistoffet (traceren) er i sin tur konjugert med et enzym som kan detekteres.

Inhibisjons-ELISA

I denne teknikk lar man først prøven med det antistoff man vil bestemme reagere med antigenet, som er bundet på mikrotiterplatens overflate. I neste steg setter man til en tracer. Denne tracer er av nøyaktig samme type av antistoff, rettat mot nøyaktig samme antigen som det i prøven, men med enzym konjugert, det vil si bundet til seg. Jo mer antistoff det fantes i prøveløsningen, desto mindre plass er det nå for tracer-antistoffet å binde til antigenet på mikrotitrerplaten. Her kommer altså et større gehalt antistoffer i prøven å gi opphav til en lavere signal.

Utenom den sekvensielle metode som beskrives her, kan bestemmelsen også gjøres kompetitivt, det vil si ved at prøve og tracer tilsettes på mikrotitrerplaten samtidig. Nøyaktigheten i testen blir da noe lavere, men til gjengjeld sparer man et steg i analysegangen og forenkler den.

I samtlige av disse tekniker er det mulig å kaste om på rekkefølgen av antigen og antistoff, og for eksempel koble antistoff til mikrotitrerplaten og/eller å konjugere et antigen til enzym og benytte dette som tracer.

Historikk

ELISA ble skapt i 1971 av Peter Perlmann og Eva Engvall ved Stockholms universitet. Samme år ble det skapt en svært likeartet metode under betegnelsen Enzyme Immunoassay, EIA, av de to nederlandske forskerne Anton Schuurs og Bauke van Weemen ved selskapet NV Organon, uavhengig av Perlmann og Engvall.

Før ELISA fantes metoden radioimmunologisk analyse (RIA), som første gang ble beskrevet i 1960, og som utnyttet radioaktivitet for merking og detektering av reaksjonsmaterialet. RIA ble utviklet til en svært anvendbar og følsomt metode, men en av fordelene med ELISA fremfor RIA var at man slipper å arbeide med radioaktive stoffer, ved å istedet utnytte enzymer for merking. At det skulle være mulig å merke antistoffer med enzymer, som er relativt store molekyler, uten at deres egenskaper ble merkbart endret, var først ikke åpenbart. Flere forskergrupper arbeidet imidlertid med dette på slutten av 1960-årene, og forskerne bak ELISA og EIA bygde videre på deres resultater.

Gjennombruddet for ELISA kom på slutten av 1970-årene og begynnelsen av 1980-årene, da analyseutrustninger baserte på metoden hadde oppnådd samme følsomhet som RIA.

Se også

• Klinisk kjemi
• Immunanalyse