Western blot

Fra Wikipedia, den frie encyklopedi
Hopp til navigering Hopp til søk
Western blot using an antibody that recognizes proteins modified with lipoic acid

Western blot, WB eller Western blotting, eller immunoblot, er en vanlig molekylærbiologisk metode som benyttes innen proteinkjemien for å detektere og identifisers spesifikke proteiner med hjelp av antistoffer. Western blot benyttes i prinsipp ved alle laboratorier som bedriver biomedisinsk og biomolekylær forskning, men også ved klinisk medisinsk diagnostikk i visse sammenhenger.

Uttrykket Western blot[rediger | rediger kilde]

Uttrykket er dannet i analogi med Southern blot, som er en lignende metode for å detektere DNA. Denne metoden ble oppkalt etter sin opphavsmann, den engelske biologen Edwin Southern. På lignende måte er deteksjon av RNA foretas ved en metode kalt Northern blot.[1] Uttrykket «western blot» ble gitt av W. Neal Burnette i 1981,<[2] skjønt selve metoden oppstod i 1979 i Harry Towbins laboratorium ved Friedrich Miescher Institute i Basel i Sveits.[3]

Fremgangsmåte[rediger | rediger kilde]

Det første steget ved en WB-analyse er å frembringe proteininnholdet fra de celler eller vev som skal studeres. For å separere proteinene fra cellenes andre bestanddeler må celler og vev behandles innen analysen finner sted. Vevprøver kan nedbrytes i en homogenisator eller med ultrasonikering. Celler kan behandles på samme måte som vev eller lyseres. Lysering av celler skjer ved at cellemembranen løses opp med en detergent. Det utvundne lysatet sentrifugeres for å separere proteinene fra lipider, cellekjerner og andre cellestrukturer.

Proteinene i lysatet separeres deretter med SDS-PAGE, en metode som separerer proteiner med hensyn til molekylmasse (eller molekylærvekt) som for proteiner måles i Dalton (angis oftest med prefikset kilo, kDa). SDS binder og denaturerer proteiner, og gjør dem negativt ladet. Proteinene får vandre i et elektrisk felt ved en polyakrylamidgel, der de separeres.

Neste steg, kalt blotting, er å overføre proteinene til en nitrocellulose- eller polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) med hjelp av en elektrisk spenning. Når proteinene er blitt overført, blokkes membranen for å forhindre uspesifikk binding av antistoffene til membranens overflate. Vanlige blokkløsninger lages av bovint serumalbumin (BSA) eller fettfri tørrmelk.

Etter blokkingen appliseres et spesifikt antistoff (primært antistoff) på membranen, hvis spesifisitet gjør at det binder til det proteinet som er av interesse. Deretter appliseres er sekundært antisroff som binder til der primære antistoffet. Det sekundære antistoffet er lenket til et enzym hvis katalytiske egenskap omvandler et substrat til et detekterbart produkt. Produktet kan ses direkte ved et fargeomslag på membranen eller indirekte ved å sende ut kjemiluminescent lys som kan fanges på lyssensitiv film, ses med CCD-kamera eller med en type phosphorimager.

Referanser[rediger | rediger kilde]

  1. ^ «Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes». Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 74 (12): 5350–5354. 1977. Bibcode:1977PNAS...74.5350A. PMC 431715Åpent tilgjengelig. PMID 414220. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. 
  2. ^ Burnette WN. (1981). «'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate—polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A». Analytical Biochemistry. 112 (2): 195–203. ISSN 0003-2697. PMID 6266278. doi:10.1016/0003-2697(81)90281-5. 
  3. ^ «Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications». Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9): 4350–54. 1979. Bibcode:1979PNAS...76.4350T. PMC 411572Åpent tilgjengelig. PMID 388439. doi:10.1073/pnas.76.9.4350. 

Eksterne lenker[rediger | rediger kilde]

(en) Western blot – kategori av bilder, video eller lyd på Commons Redigér på wikidata